en متوقف شدن روند آندوسیتوز کانال پتاسیمی ROMK2 (Kir1.1b) در اثر موتاسیون S362A درغشاء اووسیت های Xenopus laevis Cell, Stem Cell and Cancer Cell, Stem Cell and Cancer Experimental research article Experimental research article متوقف شدن روند آندوسیتوز کانال پتاسیمی ROMK2 (Kir1.1b) در اثر موتاسیون S362A درغشاء اووسیت های Xenopus laevis سعید حاجی هاشمی1 1- استادیار، دکتری تخصصی فیزیولوژی ،عضو هیئت علمی ، گروه فیزیولوژی ،دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی اراک چکیده: مقدمه : کانال های پتاسیمی ROMK در غشاء راسی سلولهای کلیه قرار گرفته اند. ایزو فورم های مختلفی از کانال پتاسیمی ROMK در قسمت های انتهای نفرون و در مجاری جمع کننده شناسایی شده اند که وظیفه ترشح یون K+ را بر عهده دارند. تحقیقات نشان داده اند که آندوسیتوز کانالهای پتاسیمی ROMK برای ترشح K+ در مجاری جمع کننده نقش مهمی دارا می باشد. در این مطالعه اثرات موتاسیون S362A (جایگزین کردن اسید آمینه سرین در جایگاه شماره 362با اسید امینه آلانین) بر روی اندوسیتوزکانال پتاسیمی ROMK2 پس از بیان درغشاء اووسیت بررسی گردیده است. روش کار:در این پ‍ژ‍وهش تجربی اووسیت های Xenopus laevis با استفاده از کلاژناز به روش استاندارد جدا گردیدند و جهت ایجاد موتاسیون در انتهای کربوکسیل کانال پتاسیمی ROMK2 با استفاده از روش ایجادتغییر سریع ایجاد موتاسیون زای مستقیم گردید. cRNA ای کهROMK2 وموتاسیون S362A را کد می کرد به اووسیت ها تزریق شد. پس از گذشت سه روز( زمان صفر) به محیط کشت برفلدین A (+BFA) مهار کننده انتقال پروتئینهای ساخته شده به غشاء به مقدار 25 میکرومولار یا اتانول به عنوان حلال BFA(BFA -) اضافه گردید. با استفاده از تکنیک ثابت نگه داشتن ولتاژ با استفاده از دو الکترود جریانهای یونی مربوط به کانال های پتاسیمی ROMK2 و موتاسیون S362A اندازه گیری گردید. نتایج: یافته ها نشان داد که مقدار جریان یونی پتاسیم از کانالهای پتاسیمی ROMK2با موتاسیون S362A بر خلاف کانال های پتاسیمی بدون موتاسیونROMK2 پس از انکوبه شدن در محلول 25 میکرو مولار BFA کاهش معنی داری پیدا نکرد. برای ROMK2 پس از اینکه اووسیت ها 48 ساعت تحت تاثیر BFA بودند میزان کسر جریان برابر با 0.24  0.05 (n=16)بود. این نتایج افزایش پایداری وثبات کانالهای پتاسیمی ROMK2 درغشاء بعدازایجاد موتاسیون S362A را نشان می دهد نتیجه گیری: قسمت داخلی ناحیه PDZ به ترتیب با اسید های سرین – گلوتامیک اسید - والین ( S-E-V) در تعیین پایداری و آندوسیتوز کانالهای پتاسیمیROMK2 در غشاء سلول خالت دارد. کلید واژگان: ROMK2، موتاسیون S362A ، BFA ، ناحیه PDZ نویسنده مسئول: اراک ،میدان بسیج ، مجتمع دانشگاه علوم پزشکی اراک ، دانشکده پزشکی ،گروه فیزیولوژی Email:hajihashemi@hotmail.com Abstract The S362A mutation block ROMK2 (Kir1.1b) endocytosis in Xenopus laevis oocyte membrane . Saeed Hajihashemi1 , 1-Assistant professor, PhD in Physiology, Department of Physiology, School of Medical science, Arak University of Medical Sciences. Introduction: ROMK channel is localized on the apical membrane of the nephron. Recent studies suggest that endocytosis of ROMK channels is important for regulation of K+ secretion in cortical collecting ducts. In this study the effect of S362A mutation is examined on the membrane turnover and stability of ROMK2 channel when expressing in Xenopus laevis oocytes. Materials and Methods: In this experimental study oocytes were isolated by standard protocols using collagenase (Type 1A). Mutations of the cytoplasmic termini of ROMK2 were constructed using the quik-change approach for site-directed mutagensis. Xenopus oocytes were injected with cRNA encoding ROMK2 or S362A mutant three days prior to treatment with BFA solution (time 0). Brefeldin A (BFA) was added to the OR3 medium (+BFA) at concentrations of 25µM (inhibit insertion of new proteins into the cell membrane) or ethanol as BFA vehicle (-BFA). Two-electrode voltage clamp (TEVC) was used to measure oocyte ROMK-dependent currents and membrane potential. Data was analyzed using Student’s t-tests or ANOVA as appropriate. Results: Incubation of oocytes expressing ROMK2 channels in 25 μM BFA caused a reduction in the currents and membrane voltage. In oocytes expressing the S362A mutant, there was no decay in current and membrane voltage after 48 hours incubation with BFA at 25 µM. The fractional current for ROMK2 at 48h following treatment of oocytes with BFA was 0.24 0.05 (n=24) which was significantly different to S362A mutant (0.96 0.05 n=24). Conclusion: These results show that the S362A mutation increases the general stability of ROMK and renderes the protein resistant to endocytosis, consistent with the idea that there is an interaction between the C-terminal of ROMK2 and components of the endocytotic pathway. A functional PDZ domain (the S-E-V) plays a key role in determining stability of ROMK. Key words: ROMK2, S362A mutant, BFA, PDZ domain ROMK2، موتاسیون S362A ، BFA ، ناحیه PDZ ROMK2, S362A mutant, BFA, PDZ domain 48 56 http://ppj.phypha.ir/browse.php?a_code=A-10-273-1&slc_lang=en&sid=1 Saeed Hajihashemi hajihashemi@hotmail.com 320031947532846005449 320031947532846005449 Yes